一、原理

Western Blot技术与Southern或Northern杂交法类似，但主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来检测蛋白质。检测过程中，使用抗体作为“探针”，通过标记的二抗进行显色。蛋白质样品经过PAGE分离后，转移至固相载体（如硝酸纤维素膜），固相载体通过非共价键吸附蛋白质，保持电泳分离的多肽类型及生物活性不变。固定在固相载体上的蛋白质或多肽用作抗原，进行免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，最终通过底物显色或放射自显影检测特定蛋白质表达情况。Western Blot技术在检测蛋白质表达水平时，既可以定性，也可以进行半定量，是一种方便且通用的初步鉴定方法。

Western Blot显色的方法主要包括：放射自显影、底物化学发光（ECL）、底物荧光（ECF）和底物DAB呈色。其中，底物化学发光（ECL）和DAB呈色是常用的方法。使用现成的试剂盒进行操作相对简单，基于以下原理（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物加鲁米诺，当遇到HRP时会发光，从而使胶片曝光，形成条带。

二、操作步骤

(一) 配制凝胶

1. 确保玻璃板清洁，使用ddH2O冲洗后，将接触胶面向下放在干净的纸巾上晾干。可以提前配制分离胶和浓缩胶（不含AP和TEMED），过滤后避光存放于4℃，至少可保存1个月。使用时需使其在室温平衡。

2. 封胶时，灌入2/3的分离胶后，立即使用0.1% SDS或水饱和的异/丁醇封胶。确认胶凝后，倾倒封胶液，用清水和ddH2O冲洗干净，再用0.1% SDS处理以去除残留水滴。

3. 浓缩胶在1小时后拔除梳子，注意边加水边拔，以防气泡进入梳孔。如有必要，及时用适当针头纠正变形。

(二) 样品处理

样品处理分为定性和定量方法。对于培养细胞，需用温PBS冲洗，并加入冰冷的裂解液，放置于冰上，最后进行超声处理并离心。在处理组织时，保持低温快速匀浆，注意蛋白样品的一致性，有利于后续实验的重复性和准确性。

(三) 电泳

样品上胶前需消除气泡，确保所有蛋白样品等浓度上样。使用初始电压进行稳流电泳，当电压达到65V时改为稳压电泳，直至目标蛋白迁移至距离胶下缘1cm以上。

(四) 转膜

湿转法使用的转移液需在电泳结束前20分钟进行准备。NC膜需在去离子水中浸泡，以确保吸水良好，然后浸入转移液。膜与滤纸按顺序铺好后，进行转膜操作，注意电流强度和时间需根据不同蛋白进行调整。

(五) 封闭及杂交

膜在转膜后需进行封闭，使用PBST或TTBS洗涤后，浸没于封闭液中。随后，加入一抗进行结合，并在室温或4℃下孵育。从而通过多次洗涤去除未结合的一抗。

在添加二抗时，需选择合适的抗体，确定稀释比例，并进行温和摇匀孵育。最后，进行多次洗涤以去除多余的二抗。

(六) 发光鉴定

一般采用HRP-ECL发光法或AP-NBT/BICP显色法进行鉴定，通过适当的曝光时间和显影过程获得清晰的蛋白质条带，并根据Marker进行分析和扫描。

三、注意事项

如目标条带未出现或偏淡，可以尝试延长洗涤时间和曝光时间，以增强发光强度。确保一抗的孵育时间及温度适宜，二抗杂交的条件需根据具体实验进行调整。在多次使用的NC膜上，可以通过更换洗涤液和加强洗涤来去除多余的背景信号，优化试验结果。

Western Blot是研究蛋白质表达的强有力工具，结合尊龙凯时等优质试剂和材料，可以显著提高蛋白质检测的灵敏度及准确性，为生物医疗研究提供可靠的支持。