邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种灵敏度极高的分子检测方法，专用于在单细胞层面可视化蛋白质之间的相互作用。这项技术利用特异性抗体来识别和结合目标蛋白，随后通过具有一段寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的PLA探针与之结合。当两个目标蛋白接近时，它们各自的PLA探针上的DNA会发生配对，并在连接酶的作用下形成一个环状结构，最终通过滚环扩增（RCA）产生可检测的信号。

PLA技术的独特之处在于其依赖于亲和探针在近距离（<40nm）对目标分子的精确识别，从而将蛋白质检测转化为对DNA核酸序列的检测。这一转变使得对特定蛋白质的检测、定量和定位成为可能。相较于传统的Co-IP技术，PLA不仅能够揭示蛋白质相互作用的位置，也可以与病理学技术结合，观察特定细胞内的蛋白质相互作用情况。通过荧光强度，研究人员可以反映出蛋白质相互作用的强弱，从而真正实现了对蛋白质相互作用的可视化。

PLA的实验流程

经典的PLA实验流程包括以下几个步骤：

1. 样本处理：使用多聚甲醛固定处理好的细胞爬片，组织样本经过石蜡包埋和切片后进行脱蜡处理。
2. 封闭：将封闭液均匀滴加到细胞爬片或组织切片上，确保覆盖整个组织区域。
3. 孵育一抗：将稀释好的抗体均匀滴加在封闭后的细胞爬片或组织切片上，放入湿盒中于37°C下孵育，以确保抗体与抗原充分结合。
4. 孵育PLA探针：清洗后加入PLUS和MINUS两种PLA探针。
5. 连接反应：添加连接缓冲液（含连接酶），将载玻片置于预热的湿盒中，进行连接反应。
6. 扩增及成像：清洗掉连接缓冲液，加入扩增缓冲液（含聚合酶），使用荧光显微镜观察蛋白质之间的相互作用。

PLA在生物医学领域的应用

PLA技术在生物医学领域中发挥着越来越重要的作用。首先，在蛋白质相互作用研究中，PLA结合抗体的特异性与PCR的高灵敏度，可以高度敏感地检测蛋白质之间的相互作用。比如，研究人员利用PLA技术发现Jurkat细胞内ZAP-70和TCRzeta蛋白的相互作用主要发生在细胞质中。

其次，PLA还被应用于组织样本的分析。例如，LRRK2激酶在帕金森病中扮演重要角色。研究表明，LRRK2激酶的活性依赖于pS1292蛋白，且当两者结合时，LRRK2激酶被激活。应用PLA技术，研究者观察到LRRK2与pS1292蛋白在多巴胺神经元中的相互作用，且此技术能够定量分析这种相互作用的强度，这在传统的Co-IP技术中是无法实现的。

此外，PLA不仅可以用于蛋白质的相互作用验证，也适用于蛋白质与RNA之间的相互作用研究。通过合成生物素标记的RNA探针并转染细胞，研究者可以探查FXR1蛋白与cMYC的mRNA段的结合情况。这种方法能够有效识别并定位RNA-蛋白质的相互作用，对于探索细胞内复杂的转录和翻译调控具有重要意义。

总之，邻近连接技术（PLA）以其高灵敏度和高特异性，成为一种在生物医学研究中不可或缺的工具。随着技术的不断发展和完善，尊龙凯时相信PLA技术将在更多领域发挥重要作用，为生物医学研究提供更精准的检测手段。

在未来，PLA将在微量样本检测、单细胞蛋白互作分析及药物筛选等多个方面展现出无限的潜力和广阔的应用前景。